熒光標記的siRNA  Fluorescent dye labeled siRNA

熒光標記的siRNA

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記。標記后的siRNA可用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。

我們可對siRNA末端用多種熒光標記物進行標記。標記后的siRNA可用流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察到，確定轉(zhuǎn)染效率，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件;標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。反義鏈5'端標記會影響其基因沉默活性，所以不推薦在這一位點進行標記。在其他三個末端修飾對沉默活性幾乎沒有影響。我們推薦在正義鏈的5'端修飾，目前公認這是*佳的化學標記位點。

本公司提供的siRNA相關(guān)產(chǎn)品直接作用于靶基因mRNA，因此我們建議您在收到我們的相關(guān)產(chǎn)品后先進行實時定量PCR檢測，以確定靶基因mRNA表達水平的變化，進而直接確認我們合成或構(gòu)建的siRNA產(chǎn)品是否有效。

使用方法

一、熒光標記的siRNA

轉(zhuǎn)染效率的高低可以通過熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）實現(xiàn)。

FAM-siRNA 轉(zhuǎn)染細胞后，可以用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等檢測，確定是否有效轉(zhuǎn)染和優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。FAM-siRNA 還可用作siRNA 胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA 的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。

二、使用熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）檢測轉(zhuǎn)染效率

1 FAM-siRNA的溶解及保存

1.1 由于OligoRNA很輕的干膜狀附在管壁上，打開時極易散失，所以打開離心管前先離心，然后再慢慢打開管蓋，溶解時加適量DEPC水后蓋上管蓋，振蕩溶解。

1.2 需要濃度20uM的樣品，如何計算重懸siRNA緩沖液的量？你購買了1OD的siRNA，想溶解為20uM 的樣品，應該使用150ul附送的DEPC水去重懸1OD的siRNA,溶解后為20uM的樣品。

1.3 貯存和穩(wěn)定性：-20℃，避光保存，凍干粉或液體。液體（貯存濃度為20μM）避免反復凍融，**********保證在上述條件下siRNA oligo的穩(wěn)定性可達到6個月。

2 轉(zhuǎn)染

2.1 使用lipofectamin2000 轉(zhuǎn)染的步驟（以貼壁細胞為例，僅供參考）

(1)以24孔培養(yǎng)板操作為例（其他孔板各種的試劑用量，請參照“Lipofectamine2000 manual”），轉(zhuǎn)染前**，將0.5~2X105個細胞接種于培養(yǎng)板中，每孔中加入約500ul無抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度能夠達到30～50％；

(2) 取1μl/孔 Lipofectamine2000（使用前輕輕搖勻），用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀釋。輕輕混和后在室溫孵育5 min；

(3) 取2ul FAM-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀釋，輕輕混和均勻;

(4) 稀釋的Lipofectamine2000（2）經(jīng)過5min 的孵育后，與稀釋FAM-siRNA（3）輕輕混和，室溫靜置20min，以形成FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和物，如果溶液出現(xiàn)渾濁，屬于正?，F(xiàn)象，不會影響轉(zhuǎn)染效果。

注意：稀釋的Lipofectamine2000（2）盡量在25min 之內(nèi)，和稀釋的FAM-siRNA 混和，如果放置時間過長，可能導致轉(zhuǎn)染試劑活性的降低;

(5) 將FAM-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混和液（4）加入含有細胞及培養(yǎng)液（約含400ul）的孔中，輕輕搖晃孔板，使混和；

(6) 在37 ℃的CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6 小時后可將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基(該步驟可以省略);

(7)轉(zhuǎn)染6小時后即可檢測轉(zhuǎn)染效率：流式細胞儀、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等（見后面）。

2.2 轉(zhuǎn)染操作注意事項：

（1）FAM-siRNA 的轉(zhuǎn)染過程和普通siRNA 是一樣的，注意整個實驗過程要盡量避光，建議轉(zhuǎn)染時室內(nèi)和超凈臺內(nèi)不要開燈；

（2）保持FAM-siRNA 管外有錫紙包裹，在靜置lipo-siRNA 過程中盡量避光，

（3）轉(zhuǎn)染操作盡量快，操作時間盡量短，操作完畢請盡快將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱。

（4）一般來說，使用Lipofectamine 2000 作為轉(zhuǎn)染試劑，4～6 小時就可以保證siRNA 轉(zhuǎn)染進入細胞。因此轉(zhuǎn)染效率的檢測可以在轉(zhuǎn)染后6小時（轉(zhuǎn)染過程完成）進行。

3、觀察與檢測

3.1 檢測方法：熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀

3.2 熒光顯微鏡觀察注意事項（流式細胞儀或激光共聚焦顯微鏡檢測請參照儀器說明書）：

（1）FAM 是一種綠色熒光基團，由藍光激發(fā)，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長520nm。

（2）使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染后6 小時就可以檢測，檢測前細胞處理等操作都必須避光！對于檢測的時間要求相對不是特別嚴格，成功轉(zhuǎn)染的細胞如果沒有受到強光刺激的話，熒光一般不會消失，我們建議盡量在轉(zhuǎn)染后24 小時內(nèi)完成檢測。

（3）確保熟悉熒光顯微鏡操作。建議檢測時，可以先使光路先對準沒有轉(zhuǎn)染FAM -siRNA的孔，調(diào)好焦距打開激發(fā)光，一切準備就緒后再進行觀察（一般情況下可以馬上看到熒光）。

（4）觀察時間不宜過長，盡量避免熒光被猝滅，光路對準轉(zhuǎn)染孔，馬上觀察和拍照。拍完熒光照片后，*好在同一視野中拍下明場的細胞照片。

（5）只有成功轉(zhuǎn)染的細胞才能看到FAM 綠色熒光，與綠色熒光蛋白GFP 的熒光不太一樣，F(xiàn)AM 的熒光比較弱，散在分布在細胞質(zhì)中。

（6）由于熒光容易猝滅，應用計數(shù)的方法計算轉(zhuǎn)染效率效果不好，*好用流式細胞儀檢測。

（7）如果您對我們FAM-siRNA 質(zhì)量有任何質(zhì)疑的話，您可以從中吸取少量（2～5μl）FAM-siRNA，加在載玻片上，蓋上蓋玻片，直接于熒光顯微鏡下觀察。注意保證FAM-siRNA 的保存和使用方法無誤，另外，所有操作都必須在避光條件下進行。

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